徠卡倒置熒光顯微鏡到目前為止，冰涼固定，冰凍超薄切片及冰凍干操是組織及細(xì)胞x線微區(qū)的常規(guī)方法。對(duì)該方法的細(xì)節(jié)做以下幾點(diǎn)說明：

 

徠卡倒置熒光顯微鏡一個(gè)非常重要的問題是在取材和分離細(xì)胞過程，冰凍干燥和樹脂包埋（FD）后冰凍超簿團(tuán)片后，冰凍干燥后細(xì)跑各部位65元素成分含量中必須處理十分仔細(xì)，絕不能損傷待觀察分析的細(xì)胞。因?yàn)樽鱴線微區(qū)分析不但步驟繁多，而且成本甚高，如果經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間及多步驟的處理后，所分析的細(xì)胞是受損傷的細(xì)胞或死細(xì)胞，得出錯(cuò)誤的結(jié)論是非常遺憾的。如經(jīng)過膠元酶處理分離出的心肌細(xì)胞有兩種形態(tài)，一種是長(zhǎng)桿狀，另一種是圓形。后者是在細(xì)胞分離過程中受損傷的瀕死細(xì)胞。

 

徠卡倒置熒光顯微鏡有聚光鏡的顯微鏡則可將聚光鏡作上下移動(dòng)使其亮度適中，另外也可以改變可變光闡的孔徑以達(dá)到適中9b亮度。如果光線太陽時(shí)，則可將聚光鏡作適當(dāng)?shù)南蛏仙?，可變光鬧的孔徑作適當(dāng)?shù)姆糯蟆Ｈ绻饩€太強(qiáng)則可將聚光鏡作適當(dāng)?shù)南陆?，可交光閏的孔徑作適當(dāng)?shù)臏p小。假如在這種情況下還感到刺眼，那末可選用適當(dāng)?shù)臑V光片放置在聚光鏡下的托架上。這柞就能獲得使你滿意的亮度。當(dāng)然在調(diào)節(jié)聚光鏡的上下位置利可變光閱的孔徑大小以及選用適合的濾光片，那是要經(jīng)過一定時(shí)期的實(shí)踐而取得經(jīng)驗(yàn)的。

 

徠卡倒置熒光顯微鏡這兩種細(xì)胞中電解質(zhì)的含量及分布十分不同。圓形心肌細(xì)胞中Na甚高而K極低，線枝體中的ca濃度十分高。經(jīng)過與其它分析方法核對(duì)，證明圓形細(xì)胞高Na低K及線粒體內(nèi)高ca是由于在細(xì)胞分離過程中細(xì)胞膜受損傷的結(jié)果。細(xì)胞及組織的冰涼固定方法往往是先采取淬冷固定，然后放入液氮中保存。淬冷固定對(duì)于保存的效果十分重要?；罴?xì)胞或新鮮組織中富含水分，當(dāng)淬冷時(shí)往往是細(xì)胞或組織與碎冷劑（特別是用液氮粹冷時(shí)）直接接觸的部位先冷凍固定，因而形成一個(gè)“殼”，便妨礙了細(xì)胞的中心部位碎冷固定。因此在作x一線微區(qū)分析時(shí)，常常發(fā)現(xiàn)較大的細(xì)胞的中心部位有冰晶存在。為了防止這種情況發(fā)生，便使用熔點(diǎn)比液氮高但低干一806c的物質(zhì)作碎冷劑。這類物質(zhì)很多，但zui易獲得，價(jià)格低廉的是濃態(tài)丙烷（沸點(diǎn)一42．120c，熔點(diǎn)一187．10c，分子量44．1），冷卻速度也zui快。但其缺點(diǎn)是易燃。具體操作如下，對(duì)固定單根肌纖維而言。

 

徠卡倒置熒光顯微鏡可將肌纖維放在一特制的架上，使該肌纖維收縮達(dá)到某時(shí)相需要固定時(shí)，立即啟動(dòng)噴咀，使液態(tài)丙烷向肌纖維噴射，使之淬冷固定。然后再將肌纖維連同架子取出投入液氮中。如果固定血細(xì)胞或分離的細(xì)胞，首先低速離心使細(xì)胞集中，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)導(dǎo)熱性能良好的銀質(zhì)小管中、將該小管放入液態(tài)丙烷中獰冷固定。Hall實(shí)驗(yàn)室固定大鼠胰腺時(shí)，先將兩鋼塊用液氦（或液氮）預(yù)冷，用鉗夾住兩銅塊將其放在胰腺前后，使姨腺淬冷固定。組織或細(xì)胞淬冷固定后轉(zhuǎn)移到液氮中可長(zhǎng)期保存。

 

徠卡倒置熒光顯微鏡除目前zui推崇的冰凍超薄切片法外，在這里再介紹一種科學(xué)家們用過的沉積技術(shù)。在進(jìn)行分析前加入一種物質(zhì)，使之與待分析的成份形成沉積物以固定它，然后分析該沉積物。例如，人們常用草酸鹽與焦銻酸鹽去沉積肌細(xì)胞中的ca。前者對(duì)胞漿中低濃度的ca敏感性不夠高；焦銻吱鹽的敏感性高些，可與腦漿中游離ca形成電子致密的沉積物，但焦銻酸鹽與鈉、錳、鋇、鐵也形成沉積物，特異性較差。標(biāo)本制備過程類似于普通透射電鏡超薄切片標(biāo)本的制備，不同之處在于固定前3％焦銻酸鉀（磷酸鹽緩沖液，pH7．6）固定6小時(shí)，在染色的肌肉超薄切片上，在每個(gè)肌節(jié)的A帶和2帶的中線可見黑色沉淀物、再用未染色的切片做X射線微區(qū)分析。曾用二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸（DAB）去沉淀含血紅素的物質(zhì)等等。這種組化的沉淀反應(yīng)與x射線微區(qū)分橋聯(lián)合應(yīng)用在不具備冰凍超薄切片條件的實(shí)驗(yàn)室可考慮采用。根據(jù)待分析元素的峰高可做半定量。

 

備注：徠卡倒置熒光顯微鏡關(guān)于組織塊的體積的部分新聞?dòng)?strong>北京中儀光科科技有限公司，編輯整理上傳。